构建SREBP-1c启动子报告基因时,首先需要从基因组DNA中扩增出目标启动子区域,通常选择包含关键转录因子结合位点的上游序列。扩增产物经酶切后克隆至报告基因载体(如pGL3-Basic)的多克隆位点,确保启动子位于报告基因(如荧光素酶)上游。通过测序验证插入片段的正确性和方向性。功能验证阶段,将构建好的报告基因质粒与内参质粒(如pRL-TK)共转染至相关细胞系(如HepG2肝细胞)。转染后,根据实验设计给予不同处理(如脂肪酸、胰岛素等),通过双荧光素酶报告系统检测启动子活性。比较不同处理组或突变启动子的相对荧光素酶活性,评估SREBP-1c启动子的转录调控特性。必要时,结合EMSA或ChIP实验进一步验证特定转录因子与启动子的相互作用。