CRISPR-Cas9技术中，单克隆细胞系的获得对于确保基因编辑的准确性和一致性至关重要。有限稀释法是一种常用的单克隆筛选方法，其基本原理是将细胞稀释至极低密度，使每个孔中仅含有一个细胞，从而保证后续扩增的细胞群体来源于单一祖先细胞。该方法的主要步骤包括：1.细胞计数与稀释：使用血球计数板或自动细胞计数器精确测定细胞浓度，通过系列稀释将细胞浓度调整至0.5-1个细胞/100μL。2.96孔板铺板：将稀释后的细胞悬液以100μL/孔接种至96孔板，理论上约30-40%的孔会出现单克隆生长。3.培养观察：在37℃、5%CO2培养箱中培养10-14天，定期显微镜观察确认单克隆形成情况。4.单克隆验证：通过显微镜记录各孔细胞生长情况，标记确认为单克隆的孔（即确认仅有一个细胞集落生长）。该方法的关键控制点包括：-必须进行预实验确定最佳接种密度-建议使用条件培养基提高单细胞存活率-需设置阴性对照孔监测污染情况-推荐进行多次有限稀释提高单克隆纯度有限稀释法的优势在于操作简单、成本较低，且不需要特殊设备，但需要注意该方法可能存在单细胞存活率低的问题，可通过添加ROCK抑制剂等提高克隆形成效率。
