反向PCR法是一种常用的分子生物学技术，用于构建蛋白质截短体质粒。该方法通过设计特异性引物，以含有目标基因的质粒为模板进行PCR扩增，获得线性化产物后，通过自连形成环状质粒，从而实现基因片段的删除或截短。在构建TRAF6蛋白截短体质粒时，首先需要设计一对反向引物，使其分别位于目标截短区域的两侧，且方向相反。PCR扩增后，线性化产物经过末端磷酸化处理，再通过T4DNA连接酶进行自连，转化至感受态细胞中筛选阳性克隆。最终通过测序验证截短体质粒的正确性。该方法操作简便、高效，适用于快速构建TRAF6蛋白不同功能域缺失的截短体，为后续研究其结构与功能关系提供重要工具。